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实时荧光定量PCR(Real-time PCR,QPCR,荧光定量)分类以及实验步骤介绍

   日期:2018-10-23     来源:威斯腾生物技术服务中心    浏览:3888    

实时荧光定量PCR(Real-time PCR,QPCR,荧光定量技术(Real-time quantitative PCR),是指在(QPCR,荧光定量)反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号积累实时监测整个(QPCR,荧光定量)PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,实时荧光定量PCR(Real-time PCR,QPCR,荧光定量)它具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法,目前(Real-time PCR,QPCR,荧光定量)在基因表达研究和临床疾病检测等领域已得到广泛应用(如转基因动植物检测、RNAi基因失活率检测、病原微生物或病毒含量检测、基因差异表达、基因分型)。本公司用Sybrgreen法或者Taqman法Real-time PCR,QPCR,荧光定量)对DNA/RNA 进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR) 的定量测定或型的鉴定。
实时荧光定量PCR(Real-time PCR,QPCR,荧光定量分类:

☆TaqMan荧光探针Real-time PCR,QPCR,荧光定量
    PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5‘-3‘外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

☆SYBR Green荧光染料法:Real-time PCR|QPCR
    SYBR Green是一种DNA结合染料,能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下,它不发出荧光,但一旦结合到双链DNA中以后,便可以发出荧光。Real-time PCR|QPCR实验中它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合,用于任意反应体系中。从经济角度考虑,它也比其它的探针的Real-time PCR|QPCR价格要便宜得多。但由于它能与所有的双链DNA结合,所以一旦反应体系中出现非特异扩增,那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素,可以通过选择良好的引物并优化反应条件以消除非特异性影响。


客户提供
(1)Real-time PCR|QPCR基因信息
(2)Real-time PCR|QPCR实验前尽可能新鲜和足够量的组织(≧100mg)、细胞样品(10  )或血清,或直接提供纯化好的总RAN(≧1ug)
  历经10多年的发展,实时荧光定量PCR(Real-time PCR,QPCR,荧光定量)已经由最初的简单定性发展到现在的Real-time PCR|QPCR,可以做到PCR每循环一次就收集一个数据,建立实时扩增曲线,准确地确定CT值,从而根据CT值确定起始DNA拷贝数,做到了真正意义上的DNA定量。技术的成熟,为其广泛的应用奠定了基础。
威斯腾生物|实时荧光定量PCR|Real-time PCR|QPCR|服务内容
(1)根据Real-time PCR|QPCR目的基因设计引物及引物合成
(2)RNA抽提+逆转录
(3)RNA定量及质量分析
(4)使用荧光染料SYBR Green法进行Real-time PCR|QPCR(重复三次)
(5)数据处理
实时荧光定量PCR|Real-time PCR|QPCR的原始数据。扩增产物有良好的熔解曲线,可靠的重复性
实时荧光定量PCR|Real-time PCR|QPCR 标准实验流程报告
实时荧光定量PCR|Real-time PCR|QPCR实验结果检测报告。

 

●主要实验步骤如下: 

实时荧光定量PCR(Real-time PCR)是由三个步骤组成:
1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;
2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA;
3.检测:实时检测和定量扩增的产物.

实时荧光定量PCR|Real-time PCR|QPCR中的一些术语

1 CT值:荧光信号有统计意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数,或者说是从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。

2 阈值:阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

3 CT值与起始模板的量成线性关系。

 
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